颅脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是现代战争中最主要的创伤类型，其中炸药、炮弹等爆炸所产生的冲击波是引起颅脑损伤的重要原因^[1]。美军有关退伍军人的流行病学调查研究显示，颅脑冲击伤（blast-related traumatic brain injury, bTBI）的发生率接近10%，且有15%的 bTBI 伤员会在退伍后产生一系列创伤后的心理应激反应，以创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder, PTSD）最典型^[2-3]。PTSD是一种在重大创伤事件后出现的严重精神疾病，表现出对创伤记忆的过度反应、恐惧消退受损等临床特征，对家庭和社会造成极大的负担。目前，对于bTBI与PTSD之间产生相关性的具体机制仍不清楚，导致缺少有效的诊断标志物和药物治疗靶点。

大量的研究表明，TBI导致的神经元兴奋性毒性损伤是引起继发性脑损害的重要机制之一，与突触后谷氨酸能受体功能异常密切相关^[4]。Preso（也称Preso1）是近期发现的一种突触后支架蛋白分子，可通过其FERM结构域与代谢性谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor, mGluR）形成突触后蛋白复合体，在神经元突触可塑性的调节过程中发挥重要作用^[5]。进一步的研究发现，TBI后Preso促进mGluR1介导的神经元兴奋性毒性损伤，其具体机制与Preso/mGluR1复合体的形成有关^[6]。但是，Preso/mGluR1复合体在bTBI诱导PTSD样焦虑抑郁行为中的作用尚不明确。因此，本研究在构建小鼠bTBI模型的基础上，探讨Preso/mGluR1复合体在bTBI相关PTSD中的作用机制。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

本实验采用约8周龄的雄性C57小鼠和Preso基因敲除（Preso^-/-）小鼠，分别由空军军医大学实验动物中心和上海南方模式生物科技公司提供。小鼠饲养在20～25 ℃的环境中，明暗交替时间为12 h∶12 h，通风良好，自由进食与饮水。将36只C57小鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组（Sham组）、3.5 MPa bTBI组、4.5 MPa bTBI组、5.5 MPa bTBI组、4.5 MPa bTBI+生理盐水组（bTBI+SA组）和4.5 MPa bTBI+小分子多肽组（bTBI+TAT-FERM组），每组各6只；将12只Preso^-/-小鼠适应性喂养1周后，随机分为Sham组和4.5 MPa bTBI组，每组各6只。所有动物实验均经空军军医大学动物伦理委员会批准，许可证号为20210419。

1.2   方法

1.2.1   冲击波模型的建立

本实验采用BST-Ⅰ型生物激波管（陆军军医大学大坪医院）模拟bTBI。每组6只小鼠麻醉后放于生物激波管末端动物固定架上，距离激波管末端挡板10 cm处，且均位于同一垂直平面上，右侧头部朝向冲击波来源方向，同时通过激波管爆炸冲击波（驱动段压力分别为3.5、4.5或5.5 MPa）造成单次bTBI。

1.2.2   药物干预

实验所使用的小分子干扰多肽TAT-FERM由南京金斯瑞公司合成，通过小鼠尾静脉注射的方式将TAT-FERM以3 nmol/g（小鼠体重）/天10 μg/g的剂量给药，4.5 MPa bTBI造模后连续给药5 d。

1.2.3   旷场实验

每个旷场试验箱的尺寸为40 cm × 40 cm × 35 cm，测试前首先将旷场反应箱底部、放置物以及侧壁用75%酒精清理消毒，防止之前小鼠所残留的气味、大小便等影响测试准确性；将小鼠从饲养笼里取出，背向实验者放在旷场的中央区域，拉上帘子后实验者迅速离开，任由小鼠在旷场反应箱中自由活动；测试结束后要用75%酒精清理消毒整个旷场箱体，等待晾干后更换小鼠继续重复以上实验（在测试下一只小鼠前需将酒精完全挥发）。利用Smart 3.0视频分析软件进一步分析小鼠在15 min内在中心位置的次数和运动距离百分比。如果小鼠更倾向于在旷场试验箱中间运动，被认为是抗焦虑行为，反之则是焦虑行为。

1.2.4   高架十字迷宫实验

高架十字迷宫装置通常由两段开臂和两段闭臂构成，距离地面高度51 cm，各臂长66 cm，宽5 cm，闭臂臂高15 cm，测试前要用75%酒精清理确保整个高架十字迷宫装置的清洁，尽可能创造一个干净、无味道的理想试验环境；将小鼠从饲养笼里取出，背向实验者将小鼠轻轻放在高架十字迷宫装置的中央区域，并使其面向开臂，拉上帘子后迅速安静的离开；实验结束后将其取出放回饲养笼，做好实验完成动物的标记信息，用75%酒精和纸巾清洁迷宫，等待晾干后更换小鼠继续重复以上实验。用Smart 3.0视频软件进一步分析，记录小鼠进入开臂的次数（open arm entry, OE, n_oe）和进入开臂的时间（arm opening time, OT, t_ot），进入闭臂的次数（closed arm entry, CE, n_ce）和进入闭臂的时间（arm closing time, CT, t_ct），计算小鼠进入开臂次数的百分比${\gamma _{{n_{{\text{oe}}}}}} = \dfrac{{{n_{{\text{oe}}}}}}{{{n_{{\text{oe}}}} + {n_{{\text{ce}}}}}} \times 100{\text{%}}$以及进入开臂时间的百分比${\gamma _{{t_{{\text{ot}}}}}} = \dfrac{{{t_{{\text{ot}}}}}}{{{t_{{\text{ot}}}} + {t_{{\text{ct}}}}}} \times 100{\text{%}}$。

1.2.5   免疫印记杂交（Western blot）

bTBI造模后第17 d每组取3只小鼠进行免疫印记杂交实验。提取蛋白时，在新鲜的小鼠皮层脑组织样品中加入RIPA裂解液并匀浆，离心后取上清，制备好的蛋白样品于−80 ℃保存。使用BCA法测定蛋白样品浓度，在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗Preso（1∶1000，Abclonal）、mGluR1（1∶800，Abcam）、β-actin（1∶1000，Proteintech）于4 ℃孵育过夜，在常温下二抗孵育2 h，在发光仪（ChemiDoc Touch，Bio-Rad）对条带发光。

1.2.6   苏木精-伊红(H&E)染色

bTBI造模后第17 d每组取3只小鼠进行H&E染色。将石蜡包埋好的脑组织切成10 μm薄片，然后放入甲醇中脱脂2 min，再依次浸入95%乙醇、70%乙醇和蒸馏水中进行脱水处理，每次均为2 min。将脱水后的切片依次浸入hematoxylin染料、蒸馏水、酸性洗涤剂和eosin染料中10 min，再次脱水后进行透明化处理并封片。

1.2.7   统计学分析

实验数值以x±s表示，利用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析与作图。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齐性，则用Turkey检验法进行两组间比较，以P<0.05表示数据具有统计学差异。

2.   结　果

2.1   bTBI可诱导小鼠PTSD样焦虑抑郁行为

分别使用驱动段压力为3.5、4.5和5.5 MPa的爆炸冲击波建立小鼠bTBI模型，波形曲线（图1）显示，小鼠头部实际受到的冲击波超压峰值分别为225、360和410 kPa。在造模后第15 d和第16 d分别对各组小鼠进行旷场实验和高架十字迷宫实验的行为学检验。旷场实验结果显示（表1），与Sham组相比，3.5 MPa bTBI组进入中心区域次数和中心区域运动距离百分比无明显差异；4.5和5.5 MPa bTBI组进入中心区域次数和中心区域运动距离百分比均显著降低（P<0.05）。高架十字迷宫实验结果显示（表2），与Sham组相比，bTBI各组进入开臂次数百分比（${{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{oe}}}$）和进入开臂时间百分比（${{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{ot}}}$）均显著降低（P<0.05）。在造模后第17 d H&E染色显示（图2），与Sham组相比，3.5 MPa bTBI组小鼠未见明显组织、细胞结构损伤；4.5和5.5 MPa组皮层组织出现部分细胞结构破坏。以上结果表明，bTBI可诱导小鼠PTSD样焦虑抑郁行为。

图  1  3组不同驱动压力爆炸冲击波实际加载的波形曲线

Figure  1.  Three types of waveform curves for actual loading of blast shock wave with different driving pressures

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表  1  4组小鼠旷场实验结果对比

Table  1.  Comparison of results of four groups of mice in open-field experiment

分组	进入中心区域次数	中心区域运动距离百分比/%
Sham	5.83±0.65	15.12±1.74
3.5 MPa bTBI	5.67±0.52	14.75±1.55
4.5 MPa bTBI	4.33±0.44	10.43±1.16
5.5 MPa bTBI	3.50±0.55	7.47±0.37

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表  2  4组小鼠高架十字迷宫实验结果的比较

Table  2.  Comparison of results of elevated cross maze experiments in four groups of mice

分组	${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{e}}}$/%	${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{t}}}$/%
Sham	14.02±1.32	12.15±1.55
3.5 MPa bTBI	10.57±0.83	10.03±0.54
4.5 MPa bTBI	9.41±0.96	8.11±0.88
5.5 MPa bTBI	5.38±0.75	4.95±1.28

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图  2  4组小鼠脑组织HE染色结果的比较

Figure  2.  Comparison of HE staining results in brain tissue of four groups of mice

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2.2   Preso^-/-动物bTBI造模后未见明显焦虑抑郁样行为

Zhang等^[6]前期已建立Preso^-/-动物，实验表明Preso基因敲除不影响健康成年小鼠的运动、焦虑和空间记忆。为了确定Preso是否与bTBI诱导的PTSD样焦虑抑郁行为有关，选择驱动段压力为4.5 MPa的爆炸冲击波建立bTBI模型，通过旷场实验和高架十字迷宫实验对Preso^-/-小鼠进行行为学检验。旷场实验结果（表3）显示，与Sham组相比，bTBI组进入中心区域次数和中心区域运动距离百分比无明显差异。高架十字迷宫实验结果（表4）显示，与Sham组相比，bTBI组$\mathrm{\gamma}_{n_{\mathrm{oe}}}$和$\mathrm{\gamma}_{n_{\mathrm{ot}}}$无明显差异。以上结果表明，Preso可能是bTBI诱导PTSD样焦虑抑郁状态的关键因素。

表  3  2组Preso^-/-小鼠旷场实验结果对比

Table  3.  Comparison of results of two groups of Preso^-/- mice in open-field experiment

分组	进入中心区域次数	中心区域运动距离百分比/%
Sham	6.33±0.65	14.81±0.84
bTBI	5.33±0.52	13.94±1.35

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表  4  2组Preso^-/-小鼠高架十字迷宫实验结果比较

Table  4.  Comparison of results of elevated cross maze experiments in two groups of Preso^-/- mice

分组	${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{e}}}$/%	${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{t}}}$/%
Sham	13.34±0.98	11.15±1.43
bTBI	12.55±1.28	10.03±1.24

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2.3   Preso/mGluR1复合体在bTBI后的表达变化

bTBI损伤后，对C57小鼠脑组织进行Western blot检测，结果显示bTBI组中的Preso和mGluR1与Sham组相比表达无显著性差异（图3(a)）。进一步的免疫共沉淀结果显示bTBI组中Preso与mGluR1之间的相互作用显著增多（P<0.05，图3(b)）。以上结果提示，bTBI并不影响Preso/mGluR1复合体中相关分子的表达变化，而是会增加Preso与mGluR1之间的相互作用，进而促进Preso/mGluR1复合体的形成。

图  3  Preso/mGluR1复合体在bTBI后的表达变化

Figure  3.  Alteration of Preso/mGluR1 complex after bTBI

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2.4   TAT-FERM可阻断bTBI后Preso与mGluR1之间的相互作用

针对Preso与mGluR1之间的相互作用位点设计小分子干扰多肽TAT-FERM（GRKKRRQRRRPQKTLYNVEEE），阻断Preso的FERM结构与mGluR1的结合。Western blot结果显示，bTBI+TAT-FERM组与bTBI+生理盐水（SA）组相比，Preso和mGluR1的表达未见明显改变（图4(a)），但Preso与mGluR1的相互作用显著减少（P<0.05，图4(b)），这表明TAT-FERM有效阻断了Preso与mGluR1之间的结合。

图  4  TAT-FERM对Preso/mGluR1复合体在bTBI后的表达影响

Figure  4.  Effects of TAT-FERM on Preso/mGluR1 complex after bTBI

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2.5   TAT-FERM减轻bTBI对小鼠PTSD样焦虑抑郁状态的影响

建立C57小鼠bTBI模型后连续5 d给其尾静脉注射小分子多肽TAT-FERM和生理盐水（SA），随后通过旷场实验和高架十字迷宫实验对其进行行为学检验。旷场实验结果（表5）显示，与SA组相比，TAT-FERM组进入中心区域次数无明显差异，但中心区域运动距离百分比显著升高（P<0.05）。高架十字迷宫实验结果（表6）显示，与SA组相比，TAT-FERM组的${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{e}}}$和${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{t}}}$均显著升高（P<0.05）。以上结果表明，bTBI造模能诱致小鼠PTSD样焦虑抑郁状态。

表  5  2组bTBI小鼠旷场实验结果对比

Table  5.  Comparison of results of two groups of bTBI mice in open-field experiment

给药分组	进入中心区域次数	中心区域运动距离百分比/%
SA	3.67±0.75	8.08±0.86
TAT-FERM	4.50±0.89	12.44±0.45

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表  6  2组bTBI小鼠高架十字迷宫实验结果比较

Table  6.  Comparison of results of elevated cross maze experiments in two groups of bTBI mice

分组	${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{e}}}$/%	${\mathrm{\gamma }}_{{n}_{\mathrm{o}\mathrm{t}}}$/%
SA	5.21±0.76	5.18±0.45
TAT-FERM	9.79±1.15	9.32±0.59

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3.   讨　论

既往的研究发现，TBI不但会引起急性神经系统损伤，其致伤效应还会不断累积，进而导致远期神经功能障碍，以认知障碍、情绪改变和创伤后应激等为典型症状^[7]。bTBI作为一种较特殊的TBI类型，多见于经历战场环境的军事作业人员，主要以轻型颅脑损伤为主^[8]。虽然这种冲击波引起的损伤效应并未导致明显的脑组织结构性损害，但通过对退伍军人的流行病学调查研究表明，bTBI会显著提高PTSD的发生率^[9]。

本研究通过小鼠动物模型模拟了不同致伤强度冲击波的脑损伤效应，结果显示，3.5 MPa冲击波所造成的脑损伤程度较轻，小鼠焦虑抑郁行为改变不显著；经历过4.5和5.5 MPa bTBI的实验动物PTSD样改变更显著，且与之对应的脑组织HE染色结果表明存在部分细胞结构破坏。然而，bTBI诱致PTSD的生物学机制仍需要进一步探讨。

谷氨酸受体介导的兴奋性毒性损伤是TBI后继发性脑损害形成的重要机制，其中谷氨酸受体异常激活是其中关键的分子病理改变。mGluR1是重要的谷氨酸受体亚型，在之前的研究中显示其异常激活在TBI后可加重神经元损伤^[10]。此外，mGluR1相关抑制剂可以在精神和心理疾病的治疗中发挥潜在治疗作用^[11]。但是，一系列临床研究表明，直接将mGluR1作为干预靶点进行治疗，并未在TBI后PTSD患者中发挥预期的效果，同时还带来了许多副作用^[12]。由此可见，深入探索mGluR1在TBI中的作用机理，对于寻找新的干预措施具有重要意义。

作为一种多结构域的突触后支架蛋白，Preso含有1个FERM结构域、1个WW结构域和2个PDZ结构域，其中FERM结构域可与mGluR1之间发生相互作用^{[5, 13]}。本研究进一步证实，bTBI造模未引起Preso^-/-动物明显的焦虑抑郁样行为，而bTBI造模对C57小鼠Preso和mGluR1的表达也无显著影响，但引起Preso与mGluR1之间的相互作用增强，从而促进Preso/mGluR1复合体形成。Zhang等^[6]的研究提示，调控Preso与mGluR1之间的相互作用能够阻断TBI引起的急性神经元损伤。由此推测，bTBI促进Preso/mGluR1复合体形成极有可能是其诱致PTSD症状的重要机制。

通过药理学手段干预复合体形成，是探索突触后蛋白复合体作用机制和发现干预靶点的重要方式。为了进一步明确Preso/mGluR1复合体的作用，本研究针对Preso与mGluR1发生相互作用的FERM结构域合成了小分子干扰多肽TAT-FERM。研究结果显示，TAT-FERM可以阻断bTBI后Preso与mGluR1之间的相互作用，减少Preso/mGluR1复合体形成。进一步的干预实验表明，TAT-FERM可以显著改善bTBI引起的PTSD症状。这些结果不但证实了Preso/mGluR1复合体在bTBI相关PTSD中的关键作用，同时也为开发潜在的药物治疗靶点提供了新的突破点。

4.   结　论

颅脑冲击伤（bTBI）可通过促进突触后蛋白复合体Preso/mGluR1形成，诱导bTBI相关PTSD样行为学改变，而小分子多肽TAT-FERM阻断Preso/mGluR1复合体形成可改善bTBI诱导的PTSD症状。

感谢陆军军医大学大坪医院张安强副教授团队和清华大学庄茁教授团队对实验的支持和帮助。